Vantaggi e svantaggi delle tecniche di coltura in vitro nelle piante medicinali

La tecnica della coltura in vitro di cellule e tessuti vegetali porta all'insorgenza di variazioni genetiche ereditabili (mutazioni puntiformi, alterazioni nel numero e nella struttura dei cromosomi) ed epigenetiche indotte dall'ambiente e non ereditabili (amplificazione del DNA, modificazione degli istoni, metilazione, espressione di microRNA). Questo tipo di variabilità è stata definita nel 1981 da Larkin e Scowcroft, variabilità somaclonale e da allora è stata, ed è tuttora usata per il miglioramento genetico delle piante.
I cambiamenti indotti dalla coltura in vitro, infatti in molti casi causano effetti benefici utilizzati con successo nei programmi di breeding per la generazione di varietà coltivate (cultivar) con nuove caratteristiche migliorate.
Nelle piante medicinali le tecnologie di coltura in vitro sono in genere adottate per ottenere piante non contaminate da agenti patogeni e, soprattutto per ottenere nuovi somacloni caratterizzati da un aumento della produzione di composti bioattivi, e per poterli moltiplicare mantenendo l'integrità del nuovo profilo genetico.

Ottenimento di piante "pathogens-free"
In questo caso le tecniche di coltura in vitro più utilizzate sono le tecniche di escissione dell'apice meristematico di gemme ascellari, note dalla fine degli anni 90 (Grout, 1999). La sezione di meristema escissa è tipicamente piccola (spesso <1 mm di lunghezza) e viene rimossa mediante dissezione sterile al microscopio. L'espianto non comprende eventuali tessuti pro-vascolari o vascolari differenziati. Più la dimensione dell'espianto è piccola, più viene garantita l'esclusione di organismi patogeni che potrebbero essere stati presenti nelle piante donatrici. Queste ultime possono anche essere sottoposte a trattamenti termoterapici e/o chemoterapici, prima dell'escissione dei meristemi apicali (Chadna & Choudhary, 2007). Un secondo vantaggio inerente alla tecnica è la stabilità genetica, dal momento che la produzione di piantine proviene da un meristema apicale già differenziato. Lo sviluppo dei germogli direttamente dal meristema produce uno stock di piante axeniche pronte per essere trapiantate ed evita la formazione di tessuto calloso e di organogenesi avventizia riducendo al minimo l'instaurarsi della variazione somaclonale.

Produzione di metaboliti secondari
Per la produzione di metaboliti secondari si usano invece prevalentemente la coltura di callo, le sospensioni cellulari e le tecniche di rigenerazione per organogenesi o embriogenesi somatica. Queste tecniche di coltura sono in genere accomunate dalla produzione di una massa amorfa di cellule sdifferenziate (callo) in risposta all'esposizione degli espianti di origine (qualsiasi parte di una pianta) a diversi regolatori della crescita (fitormoni). Il callo può quindi essere utilizzato per rigenerare intere piante (rigenerazione e micropropagazione in coltura solida), oppure può essere moltiplicato in coltura liquida sotto forma di sospensione cellulare in bioreattori, per la produzione su larga scala di importanti metaboliti secondari (Espinosa-Leal et al., 2018).

Questi procedimenti, grazie alla fase di sdifferenziazione cellulare inducono l'insorgenza di modificazioni genetiche o epigenetiche con la generazione dei cosiddetti varianti somaclonali. Dal punto di vista economico, i somacloni con la loro fonte di variabilità genetica possono essere, quindi sfruttati per migliorare le proprietà biochimiche delle piante medicinali.
Per esempio, Roopadarshini e Gayatri (2012), in diverse varianti somaclonali di Curcuma longa L., hanno osservato quantità significativamente più elevate di curcumina, oleoresina e contenuto di olio volatile, rispetto alla pianta di origine. Altre ricerche, condotte su Viscum album L. (una pianta medicinale con proprietà antitumorali), hanno rivelato nel 10% dei calli rigenerati da lunghi segmenti di stelo, variazioni nelle concentrazioni proteiche sei volte superiori a quelle dei tessuti della pianta madre (Kintzios et al. 2003). In rigeneranti in vitro di due diversi genotipi di Brassica juncea (una pianta medicinale molto utilizzata in medicina come trattamento per diverse patologie) sono state dimostrate una riduzione di acido erucico (sfavorevole per la dieta umana) e, quantità maggiori di acido palmitico e linolenico (considerati, invece buoni per la dieta umana) rispetto alle piante donatrici (Shyam et al. 2021). In piantine in vitro di Mentha piperita L sono state riscontrate differenze in una serie di indicatori biochimici (Radomir et al., 2022) e nei profili dell'olio essenziale (Shelepova et al., 2021) ed un significativo aumento di composti bioattivi in germogli in vitro di Salvia bulleyana (Grzegorczyk-Karolak et al. 2021). Anche in una recente ricerca frutto di una collaborazione tra il CERFIT AOU Careggi e l'Università di Firenze, l'analisi genetica e chimica di somacloni di Acmella oleracea ha rilevato importanti caratteristiche del profilo metabolico di questa importante pianta medicinale (Bellumori et al. 2022).

La comparsa di variazioni somaclonali comporta anche alcuni importanti svantaggi in quanto le variazioni sono casuali e non possono essere previste; a volte sono instabili e non ereditabili; possono altresì essere associate a caratteristiche deleterie, come diminuito potenziale di rigenerazione e ridotto tasso di crescita e di fertilità dei nuovi genotipi selezionati. E' pertanto necessaria un'accurata selezione del somaclone "vantaggioso" ed è necessario mantenere un equilibrio tra ciò che è vantaggioso e ciò che è indesiderabile, e questo implica l'approfondimento degli studi sull'origine e sui meccanismi molecolari (genetici ed epigenetici) delle variazioni somaclonali, nonché lo sviluppo di strategie efficaci per l'analisi di questa diversità (Duta-Cornescu et al. 2023).
Inoltre, per il corretto utilizzo delle variazioni somaclonali, sono necessari adeguati sistemi di rigenerazione e moltiplicazione, diversi per le diverse specie di piante medicinali caratterizzate a questo riguardo da un elevato controllo genetico.

Bellumori, M., Zonfrillo, B., Maggini, V., Bogani, P., Gallo, E., Firenzuoli, F., ... & Innocenti, M. (2022). Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 220, 114991.
Chadha, K. L., & Choudhary, M. L. (2007). Planning Commission, Government of India, 4-40.
Duta-Cornescu, G., Constantin, N., Pojoga, D. M., Nicuta, D., & Simon-Gruita, A. (2023). International Journal of Molecular Sciences, 24(1), 838.
Espinosa-Leal, C. A., Puente-Garza, C. A., & García-Lara, S. (2018). Planta, 248, 1-18.
Grout, B.W.W. (1999). Meristem-Tip Culture for Propagation and Virus Elimination. In: Hall, R.D. (eds) Plant Cell Culture Protocols. Methods In Molecular Biology™, vol 111. Humana Press. https://doi.org/10.1385/1-59259-583-9:115.
Grzegorczyk-Karolak, I., Hnatuszko-Konka, K., Krzemiñska, M., Olszewska, M. A., & Owczarek, A. (2021) Biomolecules, 11(10), 1513.
Kintzios, S.; Barberaki, M.; Drossopoulos, J.; Turgelis, P.; Konstas, J. J. Plant Nutr. 2003, 26, 369-397.
Larkin, P.; Scowcroft,W. Theor. Appl. Genet. 1981, 60, 197-214.
Radomir, A.M.; Stan, R.; Pandelea, M.L.; Vizitiu, D.E. Acta Sci. Pol. Hortorum Cultus 2022, 21, 45-52. Roopadarshini, V.; Gayatri, M.C. Res. Plant Biol. 2012, 2, 31-37.
Shelepova, O.V.; Dilovarova, T.A.; Gulevich, A.A.; Olekhnovich, L.S.; Shirokova, A.V.; Ushakova, I.T.; Baranova, E.N. Agronomy 2021, 11, 2314.
Shyam, C.; Tripathi, M.K.; Tiwari, S.; Tripathi, N.; Solanki, R.S.; Sapre, S.; Ahuja, A.; Tiwari, S. Plants 2021, 10, 1297

Patrizia Bogani
Università di Firenze